1 细胞的“质检员”：揭秘蛋白稳态与去泛素化酶的神秘面纱
蛋白稳态（proteome homeostasis）是指细胞为了维持自身正常功能，而对蛋白质的合成、折叠、构象维持与降解等过程进行精密调控来维持自身蛋白质组的稳定性和功能性形成的动态平衡状态。蛋白稳态不仅对维持正常生理功能至关重要，还在应激状态下决定细胞命运。蛋白质稳态失衡可能引发恶性肿瘤、神经退行性疾病等多种疾病。这种平衡依赖于多个相互关联的信号通路的协同合作。蛋白稳态的调控受到多个系统的调控，包括热休克反应（heat shock response，HSR）、泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）、自噬-溶酶体系统（autophagy-lysosome system，ALS）、内质网质量控制机制（ER quality control，ERQC）以及细胞对钙离子、组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和氧化应激的响应机制。
UPS在蛋白稳态中发挥着重要作用，与多个生物进程相关，是控制蛋白质降解的主要蛋白水解系统。UPS由泛素化修饰蛋白质底物的特异性酶和负责标记底物蛋白水解的26S蛋白酶体组成。泛素（ubiquitin，Ub）由76个氨基酸组成，泛素化是ATP依赖性地使用泛素级联标记底物蛋白的高度特异性过程，是仅次于磷酸化的第二常见的蛋白质翻译后修饰。泛素化修饰涉及由泛素激活酶 （ubiquitin-activating enzymes，E1）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2）和泛素连接酶（ubiquitin-protein ligases，E3）介导的一系列反应（图1）。从蛋白质底物中去除泛素，称为去泛素化，是由去泛素化酶（deubiquitylating enzyme, DUB）介导的。DUB通过识别并结合底物、裂解底物和泛素之间的共价键并释放泛素分子来逆转泛素化，从而保护蛋白质免受蛋白酶体依赖性降解。
近年来，DUB因其独特的去泛素化偏好和在各种生物过程中的关键作用而受到广泛关注，DUB对蛋白稳态的调控涉及包括肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病、炎症性疾病在内的多种人类疾病的进展。靶向DUB将有机会从蛋白稳态调控层面干预或治疗这些疾病，是有着极大潜力的研究热点内容。
2 解码DUB：找出“钥匙”与“锁芯”
2.1 DUB的结构与功能
迄今为止，人类基因组中已经被鉴定出大约100种DUB，分为7个亚家族，包括泛素特异性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs)、泛素羧基末端水解酶（ubiquitin carboxy-terminal hydrolases，UCHs)、卵巢肿瘤蛋白酶（ovarian tumour proteases，OTUs)、Machado-Joseph 病蛋白结构域蛋白酶（Machado-Joseph disease protein domain proteases，MJDs)、JAMM/MPN 区域相关金属肽酶（JAMM/MPN domain-associated metallopeptidases，JAMMs)、含锌指的泛素肽酶1（zinc finger-containing ubiquitin peptidase 1，ZUFSP）以及motif与泛素相互作用的新DUB家族 (motif interacting with ubiquitin-containing novel DUB family proteases，MINDYs)，其对应特征如图所示（图2）。
DUB通常由一个或多个用于底物识别的结合结构域组成，它们与不可或缺的催化结构域协同工作以精确控制水解。催化结构域包含水解泛素链所必需的经典催化三联体，包括半胱氨酸 （Cys）、组氨酸 （His） 和天冬氨酸 （Asp） 或谷氨酸残基。其他结构域协同工作，催化和精确调节水解，同时影响细胞定位和功能多样性。DUB的催化结构域识别并结合至至少一个泛素结合位点。DUB 可以直接结合底物以去除附着在其上的泛素，也可以识别并切割泛素链本身。
2.2 靶向DUB的策略
活化的DUB在无底物状态（substrate-free）、底物结合状态（substrate-bound）、产物结合状态（product-bound states）中不断循环（图3）。由于DUB发挥酶活催化作用的结构域较为明确，易于用小分子抑制剂调控其活性。目前研究中主流的DUB干预策略是寻找其小分子抑制剂，至今被开发的抑制剂已经覆盖了35种DUB。DUB小分子抑制剂的研发主要采用共价和非共价两种策略。一些研究将小分子靶向DUB的策略进一步分类，包括DUB活性构象的催化位点共价/非共价结合的抑制剂、与DUB非活性构象的催化位点共价/非共价结合的抑制剂、与DUB的Ub结合位点结合并阻断底物识别的竞争性抑制剂；由于一些DUB以非活性形式存在，在与底物结合或与特定的辅因子相互作用下才被激活，因此可能存在还未发现的结合于Ub结合位点外的第四类变构抑制剂（表1）。
表1：基于去泛素化酶的小分子靶向策略
3 瓦解肿瘤的“保护伞”：DUB抑制剂崭露头角
基于去泛素化酶的小分子抑制剂已被广泛用于抗肿瘤实验治疗, 多数去泛素化酶抑制剂正在临床前研究阶段，部分DUB抑制剂已经进入临床I期、临床II期，例如USP1、USP25、USP28（表2）。
USP1在调节DNA损伤反应中起关键作用。DNA损伤后，USP1通过从PCNA和 FANCD2-FANCI中去除单泛素来稳定复制叉，从而催化跨损伤合成和链间交联修复的关键步骤，此功能在 BRCA1 突变癌症中尤为重要（图4）。USP1表达和活性在BRCA1 缺陷型肿瘤、骨肉瘤、结直肠癌和其他肿瘤细胞中上调，表明这些癌症高度依赖 USP1。USP1和 BRCA1/2之间的合成致死性已通过实验得到证明，为USP1抑制剂的开发奠定了基础。此外，PARP和USP1的抑制在BRCA1/2突变肿瘤中显示出强大的协同作用。
USP25 和 USP28具有高度同源性，因此多数靶向它们的小分子抑制剂对两者均发挥抑制作用，共同抑制肿瘤进展。USP25正向调节Wnt/β-catenin 信号通路。tankyrases（TNKS）和USP25之间相互作用的破坏导致 AXIN 半衰期延长，进而激活 Wnt/β -catenin 通路，导致前列腺癌的发展。USP28 可以直接去泛素化 P53 并稳定突变的 P53，增强癌细胞的侵袭能力。膀胱癌肿瘤发生与 USP28 和 p53 表达显著相关，可能作为膀胱癌进展的标志物。
处于临床前以及目前无状态的其他DUB抑制剂也值得关注，例如USP7的高表达水平也可以改变DNA损伤反应、细胞凋亡和细胞周期调节，从而促进肿瘤的发展。P5091作为USP7和USP47的选择性双重抑制剂,可以诱导抵抗常规治疗和硼替佐米治疗的多发性骨髓瘤细胞凋亡，在多发性骨髓瘤细胞株、患者肿瘤细胞、多发性骨髓瘤异种移植动物模型以及生化和遗传模型中均显示出良好的抗肿瘤活性，P5091对野生型和突变型p53的卵巢癌细胞具有增殖抑制作用并诱导细胞坏死和凋亡, 且对野生型p53的作用效果更强。
表2 肿瘤治疗中的去泛素化酶抑制剂（最高研发状态）【数据来源：药渡数据-全球药物&器械竞争情报平台+知识图谱 (pharmacodia.com)】
4 柳暗花明：在非肿瘤疾病领域大放异彩
除了在癌症中的作用外，DUB在众多其他疾病中也扮演着关键且多样的角色，这证实了它们作为重要治疗靶点的潜力。例如，在帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病中，DUB对于维持神经元稳态和控制神经毒性蛋白聚集物的积累至关重要，因此是极具吸引力的治疗干预候选靶点。在心血管疾病领域，DUB对自噬、代谢途径和氧化应激等基本过程的调节活动，直接影响着心肌肥厚和心肌梗死等疾病的发生发展机制。同样，它们在炎症性疾病中也发挥着不可或缺的作用，通过调节免疫信号级联反应，并协调促炎与抗炎信号之间的平衡，从而直接影响类风湿性关节炎和多发性硬化症等病理过程。此外，DUB对于正常的机体发育亦是必不可少的，因为其基因的功能性突变可导致严重的神经发育障碍，这突显了它们对于维持正常生理发育的必要性。因此，全面阐明DUB在这些病理过程中的多方面功能，对于揭示疾病机制至关重要，并将促进针对多种疾病的创新性治疗策略的开发（图5）。
神经退行性疾病是一组异质性进行性、无法治愈的疾病，其特征是中枢神经系统内的逐渐退化和神经元丢失，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症。线粒体自噬受损可能导致受损线粒体的积累，从而导致神经退行性疾病的发生和进展。USP30 的缺失通过抵消α-突触核蛋白的作用来增强线粒体自噬并减少神经退化，USP30 抑制剂MTX-325显示出作为 PD 疾病缓解疗法的潜力。目前MTX-325作为USP30抑制剂用于帕金森病已经进入临床I期试验（pharmacodia.com）。
银屑病是一种免疫介导的慢性、炎症性、系统性疾病，其特征是皮肤、指甲和关节炎症，涉及细胞因子信号失调导致一些转录因子如NF-κB的激活。一些DUB调节银屑病的发病机制，如USP4通过去泛素化TAK1来调节TNFα诱导的NF-κB激活，突出了其作为治疗靶点的潜力。目前USP4抑制剂的开发进展相对较慢，仅有少数化合物报道具有抑制USP4的活性。尽管如此，上述发现强调了DUB在管理非肿瘤疾病中的重要角色。
5 未来前景：DUB靶向疗法面临的挑战与突破口
由此可见，去泛素化酶在恶性肿瘤、神经退行性疾病等发生发展过程中发挥了重要的作用，其中相当一部分去泛素化酶已成为潜在的疾病治疗靶点。然而，我们对DUB的理解仍然有限，还需要进一步探索。
首先，必须继续探索与人类疾病相关的DUB，包括发现对疾病具有更明显效应的新DUB以及找到可以通过DUB干预的新疾病类型。在其中，发现致病蛋白导致疾病的确切机制以及DUB调控致病蛋白水平的方式将是需要进一步探索的内容。
此外，开发新的靶向DUB的策略也是重要方向。目前为止仍然有一些DUB缺乏靶向手段，小分子抑制剂虽然有着低成本、易合成、渗透性高等优点，但在实际应用中仍然存在一定的局限性，原因包括引起严重的药物不良反应、产生耐药性等。近年新出现一种新的DUB靶向策略是将DUB靶向新的底物，作为PROTAC技术的新应用，采用靶向DUB嵌合体（Deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTAC）的方法来稳定或挽救在疾病中泛素化和降解的蛋白质将具有广阔的应用前景。
为了充分发挥DUB小分子抑制剂的治疗潜力，未来的研究重点应集中于提升抑制剂的选择性与优化给药策略。为了减轻或避免不良反应，一个核心方向是开发高选择性抑制剂。通过高通量筛选和基于结构生物学的药物设计，开发出能精准识别特定DUB亚型活性位点或变构位点的分子，从而避免靶向DUB家族成员间高度保守的催化结构域而引发的脱靶效应。此外，发展创新的药物递送系统，如利用纳米载体等技术，实现抑制剂在病灶组织的靶向富集，是另一条有效降低全身性毒副作用、拓宽治疗窗口的关键途径。而在克服目前肿瘤疗法产生耐药性方面，探索联合用药策略至关重要。将DUB抑制剂与其他靶向药物或传统疗法联用，有望通过协同增效或阻断代偿性信号通路，延缓甚至逆转耐药性的产生。综合这些策略，未来的DUB靶向疗法将朝着更精准、更高效、更安全的方向发展，为攻克相关顽固性疾病带来新的曙光。
供稿：肿瘤药理实验室硕士研究生 郑楚润
审核修改：李永豪
